Chromatografia gazowa z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC-FID) została użyta do oceny zawartości kanabinoidów oraz ich profilu chemicznego podczas różnych stadiów rozwoju, w celu zbadania potencjalnych różnic pomiędzy roślinami rozmnażanymi in vitro (IVP), tradycyjnymi klonami (VP) a roślinami-matkami uprawianymi w pomieszczeniach(MP-indor). Zawartość THC we wszystkich grupach rosła wraz z wiekiem aż do osiągnięcia maksimum podczas okresu kwitnięcia. Wtedy parametr ten osiąga plateau, zaraz przed okresem starzenia się rośliny. W przypadku zmian zawartości pozostałych kanabinoidów w poszczególnych etapach wzrostu również nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy badanymi grupami. W przypadku oceny jakościowej, profil kanabinoidów w poszczególnych grupach był bardzo podobny, i nie różnił się również od profilu roślin matek uprawianych na dworze. Niewielkie zaobserwowane różnice okazały się nieistotne statystycznie. Wyniki płynące z naszych badań potwierdzają, że rośliny rozmnażane przy użyciu in vitro nie różnią się zawartością kanabinoidów od roślin matek, a procedura która została użyta do klonowania in vitro może zostać użyta w przypadku komercyjnych upraw.

Cannabis sativa od dawien dawna stosowana była w celach leczniczych [1]. Gatunek ten zawiera kanabinoidy, czyli wyjątkową grupę związków terpenofenolowych, które gromadzone są w trichomach na powierzchni rośliny[2]. Ponad 70 różnych kanabinoidów zostało wyizolowanych z konopi, a najbardziej aktywnym biologicznie związkiem okazał się Δ9-tetrahydrokannabinol zwany również Δ9-THC [3]. Wzory 6 głównych kanabinoidów zostały przedstawione na rysunku 1.

Δ9-THC oprócz swoich psychoaktywnych właściwości może być stosowany również jako środek przeciwbólowy, przeciwzapalny, przeciw wymiotny lub pobudzający apetyt, co czyni ten związek przydatnym w celach terapeutycznych [4]. Terapeutyczna skuteczność konopii i Δ9-THC została dość obszernie opisana [5] [6] [7] [8] [9] [10]. Δ9-THC jest aktualnie dostępne na rynku w postaci żelatynowych kapsułek do użytku wewnętrznego, w preparacie o nazwie Marinol. Dostawa hurtowych ilości syntetycznego Δ9-THC została ograniczona do produkcji tylko tego preparatu, co utrudniło opracowanie nowych preparatów, np. czopków zawierających Δ9-THC. Z tego powodu rozważane jest pozyskiwanie Δ9-THC dzięki izolacji z materiału roślinnego. Kluczową sprawą jest pozyskanie kwiatów odpowiedniej jakości, co umożliwiłoby uzyskiwanie Δ9-THC przy użyciu niższego nakładu finansowego, niż w przypadku chemicznej syntezy Δ9-THC. Współczesne badania mają na celu ulepszenie poszczególnych odmian konopi w celu osiągnięcia dużego plonu o wysokiej zawartości THC, który mógłby być zastosowany do izolacji naturalnego THC do zastosowań farmaceutycznych.
Od lat 80 zaobserwowano zwiększającą się częstotliwość przypadków konfiskaty marihuany w USA [11] [12]. Z powodu zapylenia krzyżowego jako sposobu rozmnażania się konopi, niezwykle trudne jest utrzymanie stałego wysokiego poziomu produkcji THC w kwiatach, w przypadku uprawy z nasion, w warunkach polowych lub szklarniowych. Z tego powodu użycie zaawansowanych technik hodowli tkankowych (mikrorozmnażanie in vitro) umożliwia szybkie rozmnożenie wybranych roślin cechujących się pożądanymi przez nas parametrami. Dotychczas opracowano wiele sposobów mikrorozmnażania in vitro dla różnych genotypów konopi i miejsc pozyskiwania materiału do klonowania [13][14][15][16][17][18], a także zaobserwowano znaczne różnice w rozwoju kultur w przypadku poszczególnych metod. Ponieważ niezwykle istotne jest uzyskiwanie materiału roślinnego wysokiej jakości o stałych parametrach, została opracowana metoda rozmnażania in vitro przy użyciu segmentów węzłowych łodyg, zawierających zawiązki bocznych pędów.W celu sprawdzenia przydatności tej metody porównano ją z klasyczną metodą klonowania, pobierając klony z tej samej rośliny-matki w tym samym okresie wzrostu. Porównanie to polegało na chemicznej analizie zawartości kanabinoidów przy użyciu chromatografii gazowej.

4. Materiały i metody

Rośliny użyte do badań

Rośliny Canabis sativa użyte do badań wyrosły z wysokojakościowych meksykańskich nasion w konopnym ogrodzie na uniwersytecie Misisipi w 2006 r. Założono pole składające się z około 31 000 roślin, a każda roślina została otagowana przy pomocy kodu kreskowego w celu stworzenia dokładnego spisu roślin oraz umożliwienia identyfikacji w toku dalszych badań. Podczas kwitnienia męskie rośliny zostały usunięte w celu uniknięcia zapylenia. Spośród pozostałych żeńskich roślin wybrano 50 zdrowych osobników z różnych poletek. Materiał z tych roślin analizowano pod kątem zawartości kanabinoidów, w różnych stadiach wzrostu. W oparciu o wyniki uzyskane podczas wzrostu wegetatywnego, z kilku wybranych osobników pobrano sadzonki w celu dalszej uprawy. Klony te przeniesiono do pomieszczenia i trzymano w fazie wegetatywnej pod kombinacją 1000 watowych lamp MH i HPS. Klony uprawiane w pomieszczeniu identyfikowano na podstawie zawartości THC i innych kanabinoidów, i powiązano z odpowiednią rośliną–matką uprawianą na polu. Rośliny zostały dokładnie oznaczone i podzielone na kategorie bazując na informacjach o ich polnych roślinach-matkach. Tak wyhodowane rośliny posłużyły jako rośliny-matki uprawiane w pomieszczeniu (MP-indoor). Dla naszych badań został wybrany klon z rośliny z pola, o identyfikatorze P1-2714.
Po 6 miesiącach aklimatyzacji i wzrostu w fazie wegetatywnej pod oświetleniem 18/6, pobrano odcinki węzłowe z wybranej rośliny macierzystej do mikrorozmnażania in vitro (IVP). Po 6 tygodniach ustabilizowane i dobrze rozwinięte pędy przesadzono do medium ukorzeniającego. W tym samym czasie,z tej samej rośliny-matki pobrano klasyczne klony(VP), w postaci 6-10 cm fragmentów łodyg, i ukorzeniano w doniczkach torfowych o średnicy 5cm. Po 5 tygodniach dobrze ukorzenione IVP oraz VP przesadzono do identycznych doniczek (10cm średnicy) z identycznym medium (50% włókno kokosowe/50% komercyjna mieszanka glebowa). Oba rodzaje klonów utrzymywano w identycznych warunkach: 25 stopni (+/-3), wilgotność 55% (+/-5), 7x 1000w HID, 7x 1000w HPS, 32,5 m2. Po 4 tygodniach wzrostu rośliny przesadzono do doniczek o średnicy 30 cm.
Po kolejnych 6 tygodniach wzrostu pobrano próbki ze szczytowych części roślin w celu oznaczenia zawartości kanabinoidów w szczycie fazy wegetatywnej. Następnie oba rodzaje klonów przełączono na kwitnienie (12/12). Zapoczątkowanie kwitnienia nastąpiło w przeciągu 15 dni. Okresowe pobieranie próbek do oznaczania kanabinoidów odbywało się w tym samym czasie we wszystkich grupach roślin (klony in vitro, klony normalne, rośliny matki). Analizowano 9 klonów IVP i 9 klonów VP. Do porównania użyto danych płynących z analizy próbek pobranych w 15, 24,26, i 28 tygodniu życia roślin. Wiek liczony był od dnia pobrania klonów w przypadku VP, i od dnia przeniesienia do medium ukorzeniającego w przypadku IVP.

Szczytowe segmenty węzłowe zawierające boczne pędy ( ok. 1 cm długości) zostały przeszczepione w celu uzyskania kultur in vitro. Przeszczepiany materiał pobierany był z roślin-matek rosnących w pomieszczeniu (MP-indoor). Powierzchnia przeszczepianego materiału została zdezynfekowana przez zanurzenie w roztworze zawierającym 0,5 % NaOCl (15 % roztwór wybielacza) oraz 0,1% Tween 20 przez 20 minut. Następnie pobrany materiał przemywano 3 krotnie destylowaną wodą przez 5 minut, i zaszczepiono na pożywce. Mikrorozmnażanie i hartowanie przeprowadzano według protokołu opracowanego przez Lata i in. [19]

Świeże fragmenty szczytowe łodyg o długości 6-10 cm zawierające co najmniej 2 węzły zostały pobrane z tej samej rośliny-matki co IVP. Przy użyciu sterylnego ostrza wykonano cięcie pod kątem 45 stopni zaraz poniżej węzła, i od razu zanurzone w wodzie destylowanej, w celu uniknięcia tworzenia się pęcherzyków powietrza w łodydze. Około 2 cm dolny kawałek sadzonki zanurzano w 0,1% IBA. Podobnie jak w przypadku mikrosadzonek in vitro, klasyczne klony umieszczono w 5 cm doniczkach torfowych zawierających włókno kokosowe i mix ziemi komercyjnej w stosunku 1:1. Co najmniej jeden z węzłów pozostawał poniżej poziomu gleby w celu efektywnego ukorzenienia. Tak przygotowane klony oraz klony IVP utrzymywano w identycznych warunkach pod lampami fluorescencyjnymi. Pomimo tego że proces ukorzeniania zapoczątkowany został w ciągu 2-3 tygodni, większość klonów utrzymywano w tych warunkach przez 6 tygodni, w celu zapewnienia lepszego wzrostu wegetatywnego.

(tu pomijam dokładny opis procedury, bo kto ma dostęp do chromatografu gazowego ten wie, a kto nie ma dostępu temu nie jest to potrzebne) Próbki do badań pobierane były ze szczytowych fragmentów VP , IVP i MP-indoor w różnych okresach wzrostu i rozwoju roślin. Z materiału roślinnego każdej próbki wykonano 3 powtórzenia analiz. Wykorzystano procedurę opracowaną przez Ross i in. (metoda ta była wykorzystywana przez gnidy z DEA do analiz skonfiskowanej marihuany)[20].

Analizy statystyczne wykonano przy użyciu programu SAS 9,1, wykorzystując jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA (model efektów stałych) oraz testy.

Na ogół zawartość THC rośnie wraz ze wzrostem rośłiny aż do najwyższych wartości w szczytowym okresie kwitnięcia, następnie obserwowany jest spadek wraz z procesem starzenia się rośliny. W warunkach polowych najwyższa koncentracja THC (11,53-13,54%) została zaobserwowana u roślin pomiędzy 90 a 105 dniem (pomiędzy fazą III i IV).Spadek zawartości THC został zaobserwowany u roślin 120-dniowych. Interesującym jest fakt, że stężenie THCV stanowiło mniej niż 1% całkowitego stężenia THC w okresie zbiorów. THCV będąc homologiem THC, posiada bardzo podobną strukturę chemiczną do THC, co utrudnia rozdzielenie tych związków. Wyższe stężenie THCV w materiale roślinnym powoduje że proces izolacji czystego THC staje się droższy i bardziej skomplikowany. W wyniku tego proces selekcji roślin-matek na podstawie stężenia kanabinoidów może mieć kluczową rolę w procesie izolacji THC do celów farmaceutycznych. W związku z tym na roślinę matkę w tym eksperymencie wybrano osobnika o wysokim stężeniu THC a niskim stężeniu THCV.
Klony z rośliny matki rosnącej na zewnątrz utrzymywano w fazie wegetatywnej w kontrolowanych warunkach przez 6 miesięcy. Po tym okresie fragmenty łodyg zawierające boczne pędy zostały użyte do klonowania in vitro. Wybrana metoda mikrorozmnażania roślin jest relatywnie łatwa i cechuje się wysoką skutecznością. Ponadto obrana metoda oparta o fragmenty z bocznymi pędami zmniejsza ryzyko genetycznej niestabilności rośliny, gdyż istniejące już merystemy są bardziej odporne na powstawanie zmian w genomie, w porównaniu do metod opartych na różnicowaniu się kallusa.

Najlepszy wynik w przypadku indukcji pędów zaobserwowano w przypadku medium Murashige’a i Skoog’a zawierającego 0,5 µM TDZ. Dobrze rozwinięte pędy zostały przeniesione do medium zawierającego 0,25 µM TDZ, uzupełnionego o węgiel aktywowany oraz różne stężenia IAA, IBA oraz NAA w celu ukorzenienia sadzonek. Należy zaznaczyć, że klasyczne klony został pobrane w momencie gdy klony in vitro zostały przeniesione do medium ukorzeniającego. Oba rodzaje klonów utrzymywano w fazie wegetatywnej w takich samych warunkach pod lampami fluorescencyjnymi. Najwyższe prawdopodobieństwo ukorzenienia w przypadku klonów in vitro zaobserwowano w przypadku pożywki zawierającej 0,25 µM TDZ, 500mg/l węgla aktywowanego, oraz 2,5 µM IBA. Próbki do analiz stężenia kanabinoidów zostały pobrane ze wszystkich 3 grup roślin zaraz przed przełączeniem oświetlenia na 12/12. Kwitnienie zostało zaobserwowane po 15 dniach w przypadku roślin matek, oba rodzaje klonów zakwitły po 17 dniach.
Badanie to miało na celu określenie czy klony in vitro (hodowane przy użyciu specjalnej procedury[19] ) będą miały identyczne stężenie kanabinoidów co klony pobrane w klasyczny sposób. Istotne różnice pomiędzy roślinami-matkami a klonami in-vitro obserwowano w przypadku wykorzystania innych metod mikrorozmnażania, w wyniku zachodzenia wielu mutacji somatycznych [24] [25] [26] [27]. Ponieważ celem tego badania było opracowanie metody mikrorozmnażania in vitro, która mogła by być użyta w komercyjnych projektach uprawy Cannabis sativa, niezbędne było upewnienie się, że wybrana metoda nie powoduje nieporządanych mutacji mających wpływ na metabolizm, a co za tym idzie na stężenie kanabinoidów. W tym celu badano stężenia kanabinoidów roślin matek i pobranych klonów w różnych stadiach rozwoju roślin.

Stężenie kanabinoidów w 3 badanych grupach roślin (klony VP i IVP, MP-indoor) okazało się identyczne. Podobne wyniki otrzymali Ma i Gang [28] w przypadku imbiru uprawianego w szklarni i klonów pobranych z tych roślin. Stabilność genetyczna mikrosadzonek hodowanych przy użyciu opracowanej przez nas metody została sprawdzona przy użyciu markerów ISSR [29].
Różnice w zawartości Δ9-THC podczas poszczególnych faz wzrostu i rozwoju roślin zostały przedstawione na rysunku 4. Najwyższe stężenie Δ9-THC zostało osiągnięte w 24 tygodniu życia roślin i utrzymywało się przez około 2 tygodnie.

Spadek stężenia CBC wraz z wiekiem obserwowany był we wszystkich grupach roślin. Najsilniejsze zmniejszenie zawartości CBC występowało zaraz po zakończeniu fazy wegetatywnej, w późniejszych okresach spadek ten był mniej intensywny. Zmiany stężenia CBG w czasie trwania życia roślin były podobne do zmian obserwowanych w przypadku THC, THCV i CBD. We wszystkich badanych grupach roślin najwyższe stężenie CBG przypadało na szczyt fazy kwitnięcia (5x wyższe stężenie niż w fazie wegetatywnej), a podczas okresu starzenia się rośliny ilość tego kanabinoidu zmniejszała się.
W przeciwieństwie do CBC, w przypadku CBN zaobserwowano stały przyrost jego zawartości w ciągu wszystkich faz wzrostu roślin, od fazy wegetatywnej do fazy zamierania. W fazie starzenia się rośliny zaobserwowano istotne statystycznie różnice w stężeniu CBN między obydwoma rodzajami klonów. W okresie zbiorów brak istotnych różnic pomiędzy grupami. Porównanie wszystkich trzech grup roślin (VP,IVP,MP-indoor) do rośliny matki uprawianej na dworze wykazało, że charakteryzowała się ona wyższą zawartością THC. Wszystkie badane rośliny były identyczne genetycznie, więc fakt ten można wytłumaczyć różnicami w warunkach wzrostu pomiędzy uprawą wewnątrz i na dworze. Podczas słonecznego letniego dnia w Mississippi natężenie światła wynosi około 1500 µmol*m−2*s−1, podczas gdy intensywność światła w pomieszczeniu wynosiła około 700 µmol*m−2*s−1. W poprzednich badaniach zanotowano szybsze zachodzenie procesu fotosyntezy oraz lepszy wzrost w 30 stopniach C i przy natężeniu światła 1500 µmol*m−2*s−1.

Podsumowując, rośliny wyhodowane przy użyciu metod in vitro nie różnią się zawartością kanabinoidów od roślin wyhodowanych przy pomocy tradycyjnych klonów, a także od roślin matek z których pobierano materiał do klonowania. Wyniki te potwierdzają identyczność klonów in vitro i roślin matek, a także sugerują że klonowanie in vitro nie wprowadza znaczących zmian w mechanizmach biochemicznych roślin. Metoda klonowania in vitro może być stosowana w komercyjnych hodowlach o przeznaczeniu farmaceutycznym.

1 Doyle E, Spence A A. Cannabis as a medicine?. Br J Anaesth 1995; 74: 359-361 2 Hammond C T, Mahlberg P G. Morphogenesis of capitate glandular hairs of Cannabis sativa(Cannabaceae). Am J Bot 1977; 64: 1023-1031 3 Mechoulam R, Ben-Shabat A. From gan-zi-gun-nu to anandamide and 2- arachidonoylglycerol: the ongoing story of Cannabis. Nat Prod Rep 1999; 16: 131-143 4 Sirikantaramas S, Taura F, Morimoto S, Shoyama Y. Recent advances in Cannabis sativa research: biosynthetic studies and its potential in biotechnology. Curr Pharm Biotechnol 2007; 8: 237-243 5 Brenneisen R, Egli A, ElSohly M A, Henn V, Spiess Y. The effect of orally and rectally administered Δ9-tetrahydrocannabinol on spasticity: a pilot study with 2 patients. Int J Clin Pharmacol Ther 1996; 34: 446-452 6 Formukong E A, Evans A T, Evans F. The medicinal uses of Cannabis and its constitutents. Phytother Res 1989; 3: 219-231 7 Grinspoon L, Bakalar J B. Marihuana, the forbidden medicine. New Haven; Yale University Press 1993 8 Mattes R D, Shaw L M, Eding-Owens J, Egelman K, ElSohly M A. By passing the first pass effect for therapeutic use of cannabinoids. Pharmacol Biochem Behav 1993; 44: 745-747 9 Mattes R D, Egelman K, Shaw L M, ElSohly M A. Cannabinoids appetite stimulation. Pharmacol Biochem Behav 1994; 49: 187-195 10 Mechoulam R. The pharmacohistory of Cannabis sativa. Mechoulam R Cannabinoids as therapeutic agents. Boca Raton, Florida; CRC Press 1986: 1-19 11 ElSohly M A, Ross S A, Mehmedic Z, Arafat R, Yi B, Banahan B F. Potency trends of Δ9-THC and other cannabinoids in confiscated marijuana from 1980-1997. J Forensic Sci 2000; 45: 24-30 12 Mehmedic Z, Chandra S, Slade D, Denham H, Foster S, Patel A S, Ross S A, Khan I A, ElSohly M A.Potency trends of Δ9-THC and other cannabinoids in confiscated Cannabis preparations from 1993-2008. J Forensic Sci 2010; , accepted for publication 13 Loh W H T, Hartsel S C, Robertson W. Tissue culture of Cannabis sativa L. and in vitro biotransformation of phenolics. Z Pflanzenphysiol 1983; 111: 395-400 14 Richez-Dumanois C, Braut-Boucher F, Cosson L, Paris M. Multiplication vegetative in vitro du chanvre (Cannabis sativa L.) application a la conservation des clones selections. Agronomie 1986; 6: 487-495 15 Mandolino G, Ranalli P. Advances in biotechnological approaches for hemp breeding and industry. Ranalli P Advances in hemp research. New York; Haworth Press 1999: 185-208 16 Slusarkiewicz-Jarzina A, Ponitka A, Kaczmarek Z. Influence of cultivar, explant source and plant growth regulator on callus induction and plant regeneration of Cannabis sativa L. Acta Biol Craco Series Bot 2005; 47: 145-151 17 Bing X, Ning L, Jinfeng T, Nan G. Rapid tissue culture method of Cannabis sativa for industrial uses. CN Patent 1887043 A 20070103. 2007 18 Lata H, Chandra S, Khan I, ElSohly M A. Propagation through alginate encapsulation of axillary buds ofCannabis sativa L. - an important medicinal plant. Physiol Mol Biol 2009; 15: 79-86 19 Lata H, Chandra S, Khan I, ElSohly M A. Thidiazuron induced high frequency direct shoot organogenesis of Cannabis sativa L. In Vitro Cell Dev Biol Plant 2009; 45: 12-19 20 Ross S A, Parker M, Arafat R, Lovett K, ElSohly M A. The analysis of confiscated marijuana samples for different cannabinoids using GC/FID. Am Lab 1996; 16: 16-17 21 Pierik R L M. Commercial aspects of micropropagation. Prakash J, Pierik RLM Horticulture - new technologies and applications. Dordrecht; Kluywer Academic Publisher 1991: 141-153 22 Shenoy V B, Vasil I K. Biochemical and molecular analysis of plants derived from embryogenic cultures of nipper grass (Pennisetum purpureum K. Schum). Theor Appl Genet 1992; 83: 940-955 23 Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 1962; 15: 473-497 24 Rani V, Parida P, Raina S N. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in micropropagated plants of Populus deltoides Marsh. Plant Cell Rep 1995; 14: 459-462 25 Wang X R, Szmidt A E, Nguyen H N. The phylogenetic position of the endemic flat-needle pine Pinus krempfii (Lec., Pinaceae) from Vietnam, based on PCR-RFLP analysis of chloroplast DNA. Plant Syst Evol 2000; 220: 21-36 26 Damasco O P, Graham G C, Henry R J, Adkins S W, Smith M K, Godwin I D. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) detection of dwarf off types in micropropagated Cavendish (Musa spp. AAA) bananas. Plant Cell Rep 1996; 16: 118-123 27 Salvi N D, George L, Eapen S. Plant regeneration from leaf callus of turmeric and random amplified polymorphic DNA analysis of regenerated plants. Plant Cell Tissue Organ Cult 2001; 66: 113-119 28 Ma X, Gang D R. Metabolic profiling of in vitro micropropagated and conventionally greenhouse grown ginger (Zingiber officinale). Phytochemistry 2006; 2239-2255 29 Lata H, Chandra S, Techen N, Khan I A, ElSohly M A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Med 2009; DOI: 10.1055/s-0029-1185945 , advance online publication 30 Chandra S, Lata H, Khan I A, ElSohly M A. Photosynthetic response of Cannabis sativa L. to variations in photosynthetic photon flux densities, temperature and CO2 conditions. Physiol Mol Biol Plants 2008; 14: 299-306

- użyta metoda klonowania in vitro [17](fragmenty łodyg z bocznymi pędami) daje wysoką skuteczność, oraz gwarantuje identyczność genetyczną (z którą jest cieżko przy klonowaniu z tkanki przyrannej) - jeśli pobierzemy klony (zarówno normalne jak i in vitro) i będziemy je trzymać w takich samych warunkach jak roślinę matkę to uzyskamy identyczne stężenie kanabinoidów - najlepszy wzrost pędów przy 0,5 µM TDZ w pożywce - najlepsze ukorzenianie w pożywce zawierającej 0,25 µM TDZ, 500mg/l węgla aktywowanego, oraz 2,5 µM IBA -stężenia THC, THCV, CBG, CBD rosną od fazy wegetatywnej do szczytu kwitnienia, potem spadają - przy około 430W/m2 (HPS i MH) nie uzyskano maksymalnego możliwego stężenia THC (porównując do outdoor'u w Missisipi )